Estandarización de la técnica PER-RFLP para la caracterización molecular de genotipos de Blastocystis spp en muestras de heces humanas

Abstract

Resumen: Blastocystis spp es el único Stramenopile (Sts) que parasita el intestino humano. En el humano se han reportado los Sts 1 al 9, algunos asociados con la producción de síntomas. Este proyecto se pretende estandarizar la PCR-RFLP con el fin de caracterizar genéticamente los Sts de Blastocystis spp, en muestras de heces humanas. Para la estandarización se procesaron 63 muestras: 33 de heces totales (HT), 22 de heces lavadas (HL) y 8 sedimentos de cultivos en Boeck-Drhohlav-modificado lavados (CL). El ADN se extrajo mediante 3 métodos: Wizard®, Wizard Genomic® y DNAzol®. La PCR se estandarizó para amplificar la sub-unidad ribosomal 18S, según los protocolos descritos en la literatura. El RFLP se estandarizó con las enzimas Hinf I y Rsa I, en 20 amplificados con mayor rendimiento. Para establecer si existe relación entre determinados subtipos y presencia o ausencia de síntomas gastrointestinales, se admitieron en el estudio 52 pacientes, con diagnóstico de Blastocystis spp solo o en combinación de protozoarios comensales. Como resultados se encuentra que a partir de (CL) y 22 heces lavadas (HL) con Wizard® se obtuvo el ADN más puro y menos degradado. La PCR de 1780 pb tuvo una sensibilidad de 0,3125 ng/mL de ADN y detectó un Blastocystis. La especificidad fue de 62,5% y 100% para la PCR de 1780 y 310 pb, respectivamente. En PCR de 1780 pb, de los productos inespecíficamente amplificados, no coincidió con ninguno de los polimorfismos para los Sts citados por Yoshikawa et al. (2000), validando su utilización. Mediante la aplicación PCR-RFLP, de los 52 pacientes con o sin sintomatología, el 54% (28/52) de los pacientes manifestaron presentar algún signo o síntoma intestinal, siendo la diarrea, el dolor estomacal y los gases los signos y síntomas igualmente predominantes y significativamente mayores que el estreñimiento. El 88,5% (46/52) de los pacientes tenían un subtipo de Blastocystis, proporcionalmente mayor a aquellos con la mezcla de dos subtipos 11,5% (6/52; p L 0,001). Se identificó perfiles de digestión compatibles con el St1, St3 y St4. Se observó una tendencia a una mayor frecuencia del St1 en pacientes CS y a una mayor frecuencia de St3 en pacientes SS. La estandarización de las técnicas moleculares como la PCRRFLP para la caracterización molecular de Blastocystis, abre un portal al estudio molecular del Blastocystis.