Purificación de proteínas de Trypanosoma equiperdum que presentan homología con la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de AMP cíclico

Abstract

Resumen El Trypanosoma equiperdum es un parásito hemoflagelado que infecta a animales de la familia Equidae produciendo la durina, una enfermedad venérea que compromete la vida de los animales infectados y representa grandes pérdidas económicas para la industria ganadera. La fosforilación de proteínas es uno de los mecanismos más empleados en la integración de señales en células eucariotas, este proceso es llevado a cabo por las proteínas quinasas, dentro de las cuales se destaca la proteína quinasa dependiente de adenosín monofosfato cíclico o PKA. En el genoma del T. equiperdum se han encontrado genes que codifican para proteínas que presentan homología con la PKA de mamífero, encontrándose que estas quinasas homólogas son capaces de fosforilar a los sustratos específicos de la PKA. Adicionalmente, estudios previos han mostrado que el estrés nutricional causado por la ausencia de glucosa ocasiona un aumento de la actividad quinasa en estos parásitos.En este trabajo especial de grado se purificaron parcialmente proteínas de T.equiperdum que presentan similitud tanto en sus características bioquímicas como en su función con la subunidad catalítica de la PKA de mamífero. Para ello se expresaron en bacterias y purificaron las subunidades reguladoras H6RIβ y H6RIIα(R213K) recombinantes de la PKA de mamífero, obteniendo rendimientos de 8,4mg y 6,6mg de proteína por litro de cultivo bacteriano. Estas subunidades reguladoras fueron enlazadas a resinas cromatográficas de iones inmovilizados de Ni2+, y a través de ellas se lograron formar complejos holoenzimaticos heterólogos con proteínas provenientes de la fracción soluble de parásitos T. equiperdum previamente estresados nutricionalmente al incubarlos en ausencia de glucosa.Las proteínas de T. equiperdum que interaccionaron con las subunidades H6RIβ y H6RIIα(R213K) lograron ser eluidas de las resina con 2mM de AMPc. La separación electroforética reveló que las proteínas purificadas presentaban masas moleculares aparentes de 37-39kDa y 55kDa, siendo esta última la que se encontró en mayor cantidad. Además, estas proteínas fueron reconocidas por anticuerpos dirigidos contra la subunidad catalítica de la PKA de mamífero. Ensayos quinasa realizados sobre las fracciones aisladas revelaron la presencia de proteínas con actividad quinasa, ya que fueron capaces de fosforilar un sustrato especifico de la PKA de mamífero. Palabras clave: Trypanosoma, Trypanosoma equiperdum, Proteína quinasa dependiente de AMP cíclico, PKA.