Purificación y caracterización de las isoenzimas de la pectina metilesterasa en frutos de níspero (Manilkara zapota var. Prolific)

Abstract

El Níspero (Manilkara zapota) es un fruto muy apetecido por su aroma y agradable sabor. En Venezuela la producción del níspero está limitada a pequeños y medianos productores y la causa que más ha afectado el aumento de la producción y de la oferta en el mercado de este rubro es su acelerado proceso de maduración y el inadecuado manejo postcosecha. El proceso de ablandamiento o pérdida de firmeza durante la maduración de los frutos es consecuencia de los cambios bioquímicos producidos en la pared celular. Este estudio se realizó con la finalidad de purificar y caracterizar cinéticamente las isoenzimas de la PME en frutos de níspero (Manilkara zapota var. prolific). Se colectaron frutos de níspero en estado de madurez fisiológica y se almacenaron bajo congelamiento a -20ºC. Para la extracción de la enzima se tomaron 20 g de la pulpa del fruto, se le añadió nitrógeno líquido y se pulverizó en un mortero, luego se resuspendió en 20 mL de Tris-HCl (0,1M-pH 8) y se centrifugó a 10000 rpm x 30´. La medición de la actividad enzimática se realizó de acuerdo a la metodología de Hagerman y Austin (1986). El sobrenadante obtenido (20 mL) se filtró con lana de vidrio y fue almacenado a -20 ºC. A continuación se realizó la precipitación de la enzima con sulfato de amonio líquido. El pellet obtenido fue sometido a cromatografía de fraccionamiento con Sephadex G-50. Se determinó la glicosilación de la enzima mediante cromatografía de afinidad con la ConA-Sepharosa y con el Kit de glicosilación de Sigma. Se determinaron las constantes cinéticas de Km y Vmáx, la temperatura, el pH óptimo y la estabilidad al calor. Los resultados indican la existencia de dos isoenzimas de la PME, las cuales se denominaron PMEI y PMEII. La PMEI y la PMEII tienen igual Km, Vmáx y Peso Molecular pero difieren en su pH y temperatura óptima. La Km de la PMEI y la PMEII Km es de 1,15 μg/μL y la Vmáx es de 0,078 μmol, acido/min. La temperatura óptima de la PME I es de 50 ºC y de la PME II es de 25 ºC. El pH óptimo de la PME I es de 4 y de la PME II es 10. El Peso Molecular de la PME y de la PME está entre los 15 y 20 kDa. Ambas isoenzimas son termorresistentes, sin embargo la PME II es más estable que la PME I. Las isoenzimas de la PME en frutos de níspero son glicosiladas. Estos carbohidratos están compuestos por grupos manosídicos. Se recomiendan los siguientes aspectos para profundizar en el conocimiento sobre las PME: realizar la secuenciación de las isoenzimas, liofilizar las isoenzimas PME I y PME II de frutos de níspero, hacer pruebas a nivel agroindustrial para determinar la aplicabilidad de las isoenzimas de la PME de nísperos y realizar los análisis correspondientes para determinar el porcentaje y la composición de carbohidratos de las isoenzimas PME y PME II.