Identificación de proteínas que interaccionan con una proteína de Trypanosoma evansi que presenta homología con la subunidad reguladora de la proteina quinasa dependiente de AMP cíclico

Abstract

Trypanosoma evansi infecta a una diversa gama de animales mamíferos, siendo los equinos los más afectados, ocasionándoles una enfermedad parasitaria conocida en Venezuela como la peste boba. Esta tripanosomiasis compromete el estado de salud e incide en la mortalidad de estos seres vivos, así como puede poner en riesgo factores económicos vinculados al uso de animales infectados. Las drogas farmacéuticas existentes para su erradicación no han sido eficientes, así como tampoco han sido suficientes los esfuerzos realizados en pro del desarrollo de nuevas drogas. La elucidación de las rutas de transducción de señales puede ser una herramienta útil para la identificación de blancos terapéuticos que permitan la erradicación de enfermedades parasitarias a través de la obstrucción de dichas rutas. El nucleótido adenosin 3’, 5’ monofosfato cíclico o AMPc, es una de las moléculas más conservadas en las rutas de transducción de señales en organismos eucarióticos, ya que regula una multitud de respuestas celulares a través de proteínas efectoras como las proteínas quinasas dependientes de AMPc o PKAs. En T. evansi se identificó una proteína que presenta homología con la subunidad reguladora de las PKAs de mamíferos, pero es incapaz de enlazar a nucleótidos cíclicos como el AMPc. Se ha sugerido que la región amino terminal de esta proteína pudiera estar involucrada en interacciones con otras proteínas, pudiendo estar asociada con el anclaje de las subunidades catalíticas putativas de T. evansi a los substratos que requieren ser fosforilados. En este Trabajo Especial de Grado se planteó elucidar las posibles interacciones proteína-proteína que pudieran existir entre la proteína de T. evansi que presenta homología con la subunidad reguladora de la PKA de mamífero y otras proteínas presentes en el parásito. Para ello, se determinaron las condiciones óptimas que permitieron la expresión en bacterias de la proteína de interés y de su purificación a homogeneidad. A su vez, se realizaron ensayos proteolíticos de la proteína de interés, en la que se obtuvo un patrón en el que se conservaron dos fragmentos proteolíticos de masas moleculares de 19,5 kDa y 49 kDa, sin embargo, no fue posible precisar la obtención exclusiva de sólo estos dos fragmentos. Así mismo se purificó al T. evansi de sangre de ratas, en el que se obtuvo la fracción soluble y particulada del parásito. A través de métodos cromatográficos con resinas acopladas a iones de níquel, se determinaron los enlazamientos ocurridos en la proteína de interés con otras proteínas presentes en el parásito. En estos ensayos se identificaron las masas moleculares aparentes de las proteínas que interaccionaron con la proteína de estudio. Se determinó que las proteínas presentes en la fracción soluble del parásito de masas: 46 kDa, 44,6 kDa, 37,6 kDa; así como masas de menor intensidad de: 80,6 kDa, 63 kDa, 32,5 kDa, 28,2 kDa 26,6 kDa y 20 kDa, se enlazaron con la proteína de interés. Mientras que las proteínas presentes en la fracción particulada del parásito de masas: 35,5 kDa, 40 kDa, 40,9 kDa y 42,2 kDa se enlazaron con la proteína de interés. En comparación con otros estudios realizados, se puede plantear la capacidad de la proteína de estudio de enlazar a la subunidad catalítica putativa, sirviendo como anclaje de los substratos a ser fosforilados por ésta, así como puede estar interaccionando con proteínas como ATPasas, acuaporinas o hexoquinasas putativas, que requieren ser fosforiladas. Estas evidencias corroboran lo planteado con respecto a la función asociada de la proteína de T. evansi que presenta homología con la subunidad reguladora de la PKA de mamífero.