Aislamiento y caracterización del gen hmg-coa reductasa de yuca (manihot esculenta, crantz) evaluando su expresión mediante una pcr en tiempo real

Abstract

El cultivo de yuca es de suma importancia para combatir la desnutrición en el mundo, ya que es capaz de crecer en suelos pobres y con gran sequía. Sin embargo el rápido deterioro post-cosecha resulta en pérdidas del 90% de la siembra total, por esto se han dirigido las investigaciones en biotecnología, al desarrollo de plantas de yuca resistentes a enfermedades e insectos. El gen HMG-CoA reductasa (3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA reductasa) regula la ruta metabólica del mevalonato que desencadena en la producción de metabolitos secundarios, como las fitoalexinas, compuestos que le confieren a la planta resistencia contra microorganismos patógenos y plagas. Por lo tanto se cree que el estudio de este gen y su posterior manipulación podría ayudar a disminuir el deterioro post-cosecha de los cultivos de yuca. Como objetivo inicial de este trabajo se planteó el clonamiento del gen HMG-CoA reductasa, utilizando la estrategia propuesta por Sambrook (2.001), para luego secuenciar el clon completando la secuencia parcial del gen de 1.907 pb, que fue obtenida en investigaciones previas en el laboratorio de Biotecnología Agrícola del IDEA. La publicación del genoma de yuca en noviembre de 2.009, permitió identificar la secuencia del gen HMG-CoA reductasa y enfocar el trabajo a la caracterización molecular de este gen en la planta de yuca. El análisis in sílico posibilitó la identificación de la secuencia del gen HMG-CoA reductasa en 2.493pb ordenados en 4 exones y 3 intrones, con una similitud de 97,7% del mismo gen en otras especies de plantas. El análisis de la organización la secuencia facilitó el diseño de dos pares de cebadores, para la evaluación mediante una PCR en tiempo real de los niveles de expresión del gen HMG-CoA reductasa en diferentes condiciones fisiológicas. Pero no se pudo medir la expresión debido a errores en la estandarización de la PCR, luego de normalizar las condiciones de temperatura, concentración de cloruro de magnesio y concentración de ADN se realizó la PCR en tiempo real cuyos resultados preliminares se presentaron en este trabajo.